眼感染から回復したアカントアメーバの遺伝子型、内部共生生物および臨床的特徴の評価

Aug 11, 2023

BMC 感染症第 22 巻、記事番号: 757 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

アカントアメーバは新興病原体であり、抗原虫化合物、消毒剤、過酷な環境に対する耐性で悪名高い。これは、視力を脅かす、痛みを伴う治療が難しい角膜感染症である角膜炎を引き起こすことが知られており、コンタクトレンズ装用者や眼外傷患者の間でよく報告されています。アカントアメーバは 24 種以上で構成されており、現在 23 の遺伝子型 (T1 ～ T23) が特定されています。

この後ろ向き研究は、アカントアメーバ角膜炎 (AK) 患者から回収されたアカントアメーバの種と遺伝子型を検査し、アカントアメーバの眼分離株における内部共生生物の存在を確認し、臨床症状を検討することを目的として設計されました。

2020年2月から10月までインドのハイデラバードにある三次眼科施設で治療を受けた、文化が確認されたAK患者13人がこの研究に含まれた。すべての患者の臨床症状、投薬および視覚的結果は医療記録から得られました。アカントアメーバ分離株は、リボソーム核サブユニット (rns) 遺伝子の配列を決定することによって同定されました。アカントアメーバ分離株は、分子アッセイ、PCR、および蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) を使用して、細菌または真菌の内部共生生物の存在について評価されました。

患者の平均年齢は33歳（SD ± 17.4; 95% CI 22.5～43.5歳）でした。 6 例 (46.2%) は AK 関連の危険因子を持っていました。 4人の患者は眼外傷を負い、2人はコンタクトレンズ装用者でした。 A. culbertsoni (6/13、46.2%) が最も一般的な種で、A. ポリファーガと A. トライアングルリスがそれに続きました。分離株の大部分 (12/13) は遺伝子型 T4 に属し、1 つは T12 でした。 T4 遺伝子型内で 3 つのサブクラスター T4A、T4B、および T4F が同定されました。アカントアメーバの種類と臨床転帰との間に有意な関連はありませんでした。 8 株 (61.5%) の分離株には細胞内細菌が存在し、1 株にはマラセチアレストリクタが含まれていました。細胞内微生物の存在は、50% (2/9) と比較して、間質浸潤 (88.9%、8/9)、上皮欠損 (55.6%、5/9)、および下皮損傷 (55.6%、5/9) のより高い割合と関連していた。 4)、細胞内微生物が存在しない AK 症例はそれぞれ 25% (1/4)、25% (1/4) でした。

遺伝子型 T4 はインド南部で優勢な分離株でした。これは、インドの AK 患者から同定された T12 遺伝子型の 2 番目の報告ですが、世界的にはほとんど報告されていません。この研究におけるアカントアメーバ臨床分離株の大部分は細胞内微生物を保有しており、これがAKの臨床的特徴に影響を与える可能性がある。

査読レポート

アカントアメーバ角膜炎 (AK) は、世界の角膜感染症の 2% を占める稀な眼疾患です [1]。しかし、おそらくコンタクトレンズの使用の増加と、人工プールや処理された家庭用水供給を含むさまざまな水資源でのアカントアメーバ種の蔓延の増加により、AKの症例は世界的に増加しています[2]。子供の近視の進行を抑制できるコンタクトレンズの開発の影響もあり、コンタクトレンズの装用が世界中で増加しており、これにより失明につながる可能性のあるAK感染症を発症するリスクが子供たちを危険にさらす可能性があります[3]。 AK とコンタクトレンズ装用との関連性はしっかりと確立されており、コンタクトレンズ装用は報告されている感染症のほぼ 90% に関連しています [4]。報告されたアウトブレイクは、効果のないコンタクトレンズ消毒液に関連しているとされています[5、6]。アカントアメーバのライフサイクルには、感染性栄養型と休眠嚢胞段階が含まれます。後者は何年も生存し続けることができます[7]。

AK は診断が難しく、有効な治療法は非常に限られています [8、9]。アカントアメーバの嚢胞は、消毒剤、抗原虫薬、栄養素の枯渇に対して耐性があり、患者のケアに大きな課題をもたらしています [10]。さらに、眼感染症を治療するための一般的な薬の多くは、アカントアメーバには効果がありません。 AK 患者の診断と管理は難しいため、長期にわたる投薬につながり、治療の成功が非常に困難になり、大幅な視力喪失につながる可能性があります [11]。 AK 患者の 30% では病気をコントロールするために外科的介入が必要であり、まれに感染した眼が切除されることもあります [12]。さらに、アカントアメーバ嚢胞は感染が成立すると根絶するのが難しく、感染が再発する可能性があります[13]。治療を成功させるには正しい診断が不可欠ですが、AK の臨床徴候や症状はさまざまで、単純ヘルペスウイルス (HSV) 角膜炎などの他の眼感染症と類似しているものもあるため、診断は困難な場合があります。診断が確定するまでは、鎮痛剤、抗炎症剤、一般的な抗菌化合物が処方される可能性があります。アカントアメーバ角膜感染症の診断前の局所コルチコステロイドの以前の使用は、視覚的転帰の不良と関連している[14]。多目的コンタクトレンズ溶液および確立された抗アメーバ治療法に対する耐性が疑われるAKには、新しい治療アプローチによる高感度の診断手段が必要である[15]。

90% trophozoites) grown axenically were collected in 1.5 ml eppendorf tubes and centrifuged for 5 min at 3,000 g to harvest trophozoites. The cell pellet was washed twice with 1X Page’s saline and 30µL of amoebic suspension was transferred on poly-l-lysine coated slides (Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) and left for 30 min at ambient temperature. The adherent cells were fixed by applying 30µL of freshly prepared 4% formaldehyde (buffered, pH 6.9) for 25 min. The attached amoebal cells were washed with 1X PBS, dehydrated in increasing ethanol concentrations (50%, 80%, and 96%, 3 min each) and air-dried. Intracellular bacteria were examined by hybridization using Cy3 labelled bacterial-domain specific probe EUB338 [41], and fungi using the fungus-specific probe PF2 conjugated with Hex and a Cy5 labelled EUK516 probe (Table 1) [42] for eukaryotic 18S rRNA (Biomers, Ulm, Germany). Aliquots (1µL of 50 ng/µL) of each probe were mixed with 9µL of hybridization buffer (20 mM Tris–HCl, pH 7.1, 900 mM NaCl, and 20% v/v formamide, 0.01% SDS) and added to the fixed amoebal cells on slides. Hybridization was carried out for at least 90 min at 46 °C in the dark after which slides were rinsed with 20µL of pre-warmed (48 °C) buffer (180 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.2, and 0.01% SDS). The slides were then covered with 200µL buffer and a washing step was performed at 48 °C for 25 min. All slides were quickly immersed in ice-cold MilliQ water, air dried, and were mounted using Prolong Diamond Antifade with DAPI (Thermo Fisher Scientific), then mounted slides were left overnight to cure at room temperature in the dark before imaging. Three independent assays were performed and at least 30 amoebal host cells were visualized under Olympus FV1200 confocal laser scanning microscope in Katharina Gaus Light Microscopy Facility of UNSW and FISH images were analysed in ImageJ [43]./p> 0.05). Two patients (25%, 2/8) infected by Acanthamoeba with bacterial endosymbionts had received antibiotics along with antiamoebic drugs and the ulcers of both cases were resolved after medication./p> 4 mm) was observed in 3 (23.1%) cases. Epithelial defect was noted in 6 cases (46.2%; 6.2 ± 1.7 mm), stromal infiltrates in 10 cases (76.9%; 5.0 ± 2.2 mm), and hypopyon in 6 cases (46.1%; 1.12 ± 0.6 mm). The median duration of symptoms onset was 20 days (IQR = 15—30) and the final visual acuity was not improved by ≥ 2 lines among patients with farming background (5/5, 100%), age > 32 years (4/6, 80%) and patients showing AK symptoms more than 20 days (3/6, 50%) (Additional file 1: Table S3). PHMB and chlorohexidine were the most common treatments in this study (11 cases; 84.6%). Three cases received antibiotics, one case antiviral and one case antifungal as supportive therapy (38.5%); for these there was no improvement (p > 0.05) in BCVA at final presentation compared to cases treated only with PHMB and chlorohexidine. Overall, the median duration of medical treatment was 38 days (IQR = 23—90). Of six cases with surgical treatment, 4 cases had therapeutic penetrating keratoplasty (TPK, n = 4), including one case that had an amniotic membrane transplant (Table 4). Of the remaining two cases, one had photodynamic antimicrobial therapy with rose bengal (RB-PDAT) and one underwent evisceration. Among 6 patients who had to undergo ocular surgery, 66.7% (4/6) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria./p> 32 years (80%) and cases showing keratitis symptoms for > 20 days (50%). A study from the UK has also reported worst clinical outcomes for AK patients aged > 34 years [56]. Corneal integrity weakens with age and the higher incidence of dry eyes among older populations may be possible predisposing factor for severe form of AK [9]. A previous study of bacterial keratitis from LVPEI supports the association of epithelial defect size with VA loss found in the current study [57]. Patients’ professions are often linked with the risk factors [55]. In the current study, among five cases having farming background, four (80%) had history of ocular trauma which may have been caused by non-sterile external matters as framers are frequently exposed to outdoor activities and three patients (75%, 3/5) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria. All four cases had to undergo ocular surgery but visual acuity was not improved even after postoperative recovery. Ocular trauma with contaminated objects may be an ideal vehicle for invasion of Acanthamoeba cells leading to severe form of AK. Approximately 90% of AK patients with history of eye injury had corneal grafts to restore vision in Southern China [58]./p>

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